2019年（nián）10月1日，5-羟甲基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿病研（yán）究领域取得重要进展。2型糖尿病（T2D）的血管并发症（zhèng）是（shì）导致2型糖尿病致残致死的重要病因，一（yī）直缺乏一种（zhǒng）无创便（biàn）捷的临床途径实现血管并发症（zhèng）的发生发展监测，达到早发现、早干预（yù），以提高T2D病人（rén）的整体（tǐ）生活质量，减（jiǎn）少（shǎo）卫生经（jīng）济负担。

该研（yán）究入组了62例（lì）2型（xíng）糖（táng）尿（niào）病病人，采用5hmC-Seal技术对（duì）血浆cfDNA中表（biǎo）观（guān）遗传标志物（wù）5hmC的分布情况进（jìn）行（háng）检（jiǎn）测，分析5hmC标志物与2型糖（táng）尿病血管并发（fā）症发（fā）生（shēng）发展的相关性（xìng）。结果表明5hmC标（biāo）志物的（de）变化与T2D合并大血管/微血管事件（jiàn）具有（yǒu）相关性，主要涉及一（yī）些与血管生（shēng）物（wù）学和（hé）糖尿病（包括胰岛素耐受和炎症反应）相关的基因和信号通路。该研究建立的16个（gè）基因-5hmC标志物组合（hé）检测可以准确区分有并发症和无并发（fā）症（zhèng）的2型糖尿病病（bìng）人[实验组（zǔ）：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于（yú）传统（tǒng）临床变量例如（rú）白蛋白尿。除此之外，还建（jiàn）立了13个基因-5hmC标志物组合检测，可以进一步区分（fèn）T2D合并（bìng）单一并发症和多种并发症[实验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明（míng）显优于其他传统临床变量。该研究得出（chū）结（jié）论（lùn），5hmC标志物（wù）反映了T2D病人大（dà）血（xuè）管/微血管并发症发生过程中的表（biǎo）观遗传变化，因而5hmC-Seal检测（cè）技术在监测糖尿病血管并发症发生和进展方面（miàn）具有良好的临床应用前景。

本（běn）研究（jiū）共纳（nà）入62例2型糖尿病病人，包括没有（yǒu）血（xuè）管（guǎn）并发症的病人12例，有（yǒu）单（dān）一血管并发症的病（bìng）人（rén）34例（24例发生大（dà）血管事件，10例（lì）发生（shēng）微血管事（shì）件），以及有多种血管并（bìng）发症的病人16例（lì）。试验收（shōu）集（jí）62例病（bìng）人（rén）血浆，提取cfDNA，利（lì）用5hmC-Seal技术捕获外周血cfDNA中（zhōng）的（de）5hmC序列，进行二代测序（xù），通（tōng）过生物信息学分析找出并（bìng）发症（zhèng）组与（yǔ）无并发症（zhèng）组之间有显著5hmC修饰差异的基因（yīn），单一并发症组和多种并发（fā）症组之间有显著5hmC修饰差异的基因（yīn）。随后利用回归模型对差异基因（yīn）进一步筛选、优（yōu）化，弹（dàn）性（xìng）网络进一步筛（shāi）选，计算加（jiā）权平均分（fèn），最后得到一组具有高度灵敏度和特异（yì）性的5hmC生物（wù）标记物（wù），并进一（yī）步在实验组中验证，分（fèn）析其灵敏度和特异（yì）性（xìng）。并将新建立（lì）的5hmC标志物基（jī）因组合的检测性能（néng）与传统临床（chuáng）变量进行对比分析。最后对相关基因进行了信号通路分析（xī）和功能探究（jiū）。

5hmC修饰水平（píng）与血（xuè）管并（bìng）发（fā）症具（jù）有相（xiàng）关性

利用逻辑回归模（mó）型（xíng）对62例有并发症和无并发症2型（xíng）糖尿（niào）病病人的（de）5hmC差（chà）异水（shuǐ）平进行分析发现（xiàn），有（yǒu）并发症2型（xíng）糖尿病（bìng）病人的622个（gè）差异修饰候选基因（包（bāo）括上调和下调基（jī）因（yīn））的归（guī）一化平均（jun1）数要明显高于无并（bìng）发症（zhèng）的（de）病（bìng）人（P<0.001），但（dàn）是单一并发症和多发并发症（zhèng）病（bìng）人之间没有显著（zhe）差（chà）异。

之后将有单一并发症或多种并发症（zhèng）的50例病人用逻辑回归模（mó）型进行了对比（bǐ），发现多（duō）种并发症（zhèng）的病人的153个差异（yì）修饰候选基因（包括上调和（hé）下调基因）的归一（yī）化平均数要低于无（wú）并（bìng）发症病人（P<0.001）。

5hmC标志物可（kě）区（qū）分有无并（bìng）发（fā）症患者

62例2型糖尿病病（bìng）人被随（suí）机分（fèn）成训练组（n=31）和测试组（zǔ）（n=31）。利用弹性网络筛选后发现，16基因-5hmC标志物组合检测可以用于区分有并发症（zhèng）和无并发（fā）症的2型糖尿病（bìng）病人。

基于（yú）16基因组（zǔ）合（hé）模型 (Detection Model 1) 的加权平（píng）均（jun1）分分析，发现（xiàn）无并发症（zhèng）病人的分数在训练集和测（cè）试集中都明（míng）显低于有（yǒu）并发症的病（bìng）人。只考虑加（jiā）权平均分（fèn）的话，受试者工（gōng）作特征（zhēng）曲线（ROC）分析表明将cutoff值设置成0.5时，在测试组（zǔ）中（zhōng）中的灵敏（mǐn）度（dù）为60%，特异性为（wéi）100%。

5hmC标志物可区分病人是单一并（bìng）发症（zhèng）还是（shì）多种并发症

50例（lì）有（yǒu）并（bìng）发（fā）症的2型糖尿病病（bìng）人被随机分成训练组（n=25）和测试（shì）组（zǔ）（n=25）。利（lì）用弹性网络筛选后发现，13基因（yīn）-5hmC标志物组合可以区分（fèn）2型糖（táng）尿病病人是否发生单（dān）一并（bìng）发症（zhèng）或（huò）多（duō）种（zhǒng）并发（fā）症（zhèng）。

基于13基因（yīn）组合模（mó）型（xíng） (Detection Model 2)， 我们计算了单一并发症和（hé）多种并发症的加权（quán）平均分，发现在训（xùn）练集和（hé）测试集中单（dān）一并（bìng）发（fā）症（zhèng）和多种并发症病人的分数都（dōu）有明显差异。值（zhí）得一提（tí）的是，有肾病并发症和无肾（shèn）病并（bìng）发症病人的分数也有明显差异。利用（yòng）加权平均分作（zuò）为（wéi）判断标准的受试者（zhě）工（gōng）作特征曲线（ROC）表明（míng），在（zài）测试组（zǔ）中当将cutoff值设成0.69时，灵敏（mǐn）度（dù）为87.5%，特异性（xìng）为68.8%。

5hmC标志（zhì）物与传统临床变（biàn）量（liàng）/危险因子的对比

我们评估了（le）不（bú）同临床变量（liàng）/危险因子用于监（jiān）测（cè）血管并发症（zhèng）的灵敏度和特异性（xìng）（见表1）。

信号通路分析和（hé）功能探究

有并（bìng）发（fā）症和无并发症病人的135个差（chà）异候选基因的功能注释（shì）分析表明，这些基因主要（yào）富（fù）集（jí）在一（yī）些经典的信号通路。错误发现率相关（guān）P值位于前10%和基（jī）因数目（mù）≥3的信号通路包括由（yóu）IGF1R, IL-10和FGFR2所介导的（de）信号通路。由IGF1R和IL-10介导的信号通路与胰岛素抵抗及（jí）炎症反应（yīng）相（xiàng）关，在血管生物学和糖（táng）尿病发生发展过程中发挥重要作用（yòng）。

Reactome相互作用网（wǎng）络的中心表明（míng），泛素编码基因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛（fàn）素A-52亚基核糖（táng）体蛋白融合产物1(UBA52)]是候选基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要连接者。在这135个差异候选基因中（zhōng）, 一些（xiē）基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出（chū）与糖尿病病程相关的倾向，表明5hmC和糖尿病血管并发症之（zhī）间可（kě）能存（cún）在时间依赖性的相（xiàng）互作用。基（jī）于纵向时间队列的大（dà）样（yàng）本研究（jiū），将可（kě）进（jìn）一步明确5hmC变化和糖尿病持续（xù）时间之间的动态关联。关于单一并发（fā）症和多（duō）种并发症病人的159个候选标志基因的功（gōng）能注释研究发现，存在细胞-细胞连接（jiē）、胶原蛋（dàn）白形成、新陈（chén）代谢、细胞应激应答信号通路（lù）的富（fù）集，这（zhè）些（xiē）信号通路均与细胞（bāo）基本功能密切相关（guān）。

血管并发症是（shì）三（sān）分之（zhī）二糖尿病病人的死亡原（yuán）因，若能及早有效控制血管并发症的（de）发（fā）生，将极大地改善（shàn）糖尿病病（bìng）人的生存质量。该研究建立了（le）一种利用cfDNA进行2型（xíng）糖尿病血（xuè）管（guǎn）并发症监测的无创便捷方法，较目前临床标（biāo）志物（wù）能更准确（què）地监控血管并发症的发生，从（cóng）而（ér）提示临床（chuáng）及（jí）早采（cǎi）取应（yīng）对措施，有效控制病（bìng）情进展。