2019年10月1日，5-羟甲基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿病研（yán）究领域取得重要进展。2型糖尿病（bìng）（T2D）的血管并发症是（shì）导致2型（xíng）糖尿病致残致死的重要病（bìng）因，一（yī）直缺（quē）乏一种无创便捷的临床（chuáng）途径（jìng）实现血管并发症的（de）发（fā）生（shēng）发展监测，达到早（zǎo）发现、早干预，以提高T2D病人的整体（tǐ）生活质（zhì）量，减少卫生（shēng）经济负担（dān）。

该（gāi）研究入组了62例2型糖尿（niào）病（bìng）病人（rén），采用（yòng）5hmC-Seal技术对血（xuè）浆cfDNA中表（biǎo）观遗（yí）传标志物5hmC的分布情况进行检测，分析（xī）5hmC标志物与2型糖尿（niào）病血管并发症（zhèng）发（fā）生发展的相关性（xìng）。结果表明5hmC标志物的变化与T2D合并大血管（guǎn）/微血（xuè）管事件具有相关性（xìng），主要涉及一些与血管生物学和糖尿病（包括胰岛素耐受和炎症（zhèng）反（fǎn）应）相关的基因和（hé）信号通路。该研究建立的16个基因-5hmC标志（zhì）物组合检（jiǎn）测可以准确（què）区分有并发（fā）症和无（wú）并发症的2型糖尿病病人[实（shí）验组（zǔ）：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于传统临床变（biàn）量例如白蛋白尿（niào）。除此之外（wài），还建（jiàn）立了13个基（jī）因-5hmC标志物组合检测，可以进一（yī）步区分T2D合并单一并（bìng）发症和多种并发症[实验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样（yàng）明显优于其他传统临（lín）床（chuáng）变（biàn）量。该研究得（dé）出结（jié）论，5hmC标志物反映了T2D病人大血管（guǎn）/微（wēi）血（xuè）管（guǎn）并发（fā）症发生过程中的（de）表（biǎo）观遗（yí）传变化（huà），因而5hmC-Seal检测技（jì）术（shù）在监测（cè）糖尿病血管并发症发生（shēng）和进展方面具有（yǒu）良好的临床应用前景。

本研究共纳（nà）入62例2型糖尿（niào）病（bìng）病人，包（bāo）括没有血管并发症（zhèng）的病人12例，有单一血管并发症的病人34例（lì）（24例发生大（dà）血管事件，10例（lì）发生（shēng）微血管事件），以（yǐ）及有多种血管（guǎn）并（bìng）发症（zhèng）的（de）病人16例。试验（yàn）收集62例病人血浆（jiāng），提取cfDNA，利用5hmC-Seal技术捕获外（wài）周（zhōu）血（xuè）cfDNA中（zhōng）的5hmC序列，进行二代测序，通过生物信息学分（fèn）析（xī）找出并发症组与无并发症组之间（jiān）有显著（zhe）5hmC修饰差异的（de）基因（yīn），单一并发症组和（hé）多种并（bìng）发（fā）症组之间有显著5hmC修饰差异的基因。随后利用回归模型对差（chà）异基因进一步筛选、优化，弹（dàn）性网络进（jìn）一（yī）步筛（shāi）选，计（jì）算加权平均分，最后得到（dào）一（yī）组具（jù）有高度灵敏度和（hé）特异性的5hmC生物标记物，并进一步（bù）在实验组中验证，分析其灵敏（mǐn）度和特异性（xìng）。并将新建立（lì）的5hmC标志物基因组合的（de）检测（cè）性能与传统临床变量进行对比分析。最后对相关基因进行了（le）信号通路分析和功能探究。

5hmC修饰水平与血管（guǎn）并发症具有相（xiàng）关性

利（lì）用逻辑（jí）回（huí）归模型对62例（lì）有并发症和无并发症2型糖尿病病人的5hmC差异水平（píng）进行（háng）分（fèn）析发现，有并（bìng）发症2型糖尿（niào）病病（bìng）人的622个差异修饰（shì）候（hòu）选基因（包括上调和下调基因）的（de）归一化平均数要明显高（gāo）于无并发症（zhèng）的病人（P<0.001），但是单一（yī）并（bìng）发症（zhèng）和多发并发症病人之（zhī）间（jiān）没有显著差异。

之后将（jiāng）有（yǒu）单（dān）一（yī）并发症（zhèng）或多种并发症的50例病人用逻辑回（huí）归模型进行了对比，发现多（duō）种并发症的病人的153个差异修饰候选基（jī）因（包括上调和下调基因（yīn））的归（guī）一化平均数要低于无并发（fā）症（zhèng）病人（P<0.001）。

5hmC标志物可区分有无并发（fā）症患者（zhě）

62例（lì）2型糖尿病病人被随机分（fèn）成训练组（n=31）和测试组（zǔ）（n=31）。利（lì）用弹性网络筛选后发现，16基因-5hmC标（biāo）志（zhì）物组合（hé）检测可以用于区分有（yǒu）并发症和无并发症的2型糖（táng）尿病病人。

基于16基（jī）因组合模型 (Detection Model 1) 的加权平均分分析，发现无（wú）并（bìng）发症病人（rén）的分（fèn）数在训（xùn）练集和测试（shì）集中都明显低于（yú）有并发症（zhèng）的病人。只考虑加权平均分的话，受试者工作（zuò）特（tè）征曲（qǔ）线（ROC）分析表明将cutoff值设置成0.5时，在测试组中中的灵（líng）敏度（dù）为60%，特异性为100%。

5hmC标（biāo）志物可（kě）区分病人（rén）是单一并（bìng）发症还是多种并发症（zhèng）

50例有并发症的（de）2型糖尿（niào）病病人（rén）被（bèi）随机分成训练组（n=25）和（hé）测（cè）试组（n=25）。利用弹（dàn）性网络筛选后发现，13基因-5hmC标志物组合（hé）可以区（qū）分2型糖尿病病人是否发生（shēng）单一并（bìng）发症（zhèng）或多（duō）种并发（fā）症。

基（jī）于13基（jī）因组合模型 (Detection Model 2)， 我们计（jì）算了单一（yī）并（bìng）发症和（hé）多种并发症（zhèng）的（de）加权平均（jun1）分，发现在训练集和测试集（jí）中单一并发症和多种并发症病人的分数都（dōu）有明（míng）显差异（yì）。值得一提的（de）是，有（yǒu）肾病并发症和无肾病并发症病人的分（fèn）数也有明（míng）显差异。利用加权平均分作为判断标准的受试者（zhě）工作特征曲线（xiàn）（ROC）表明（míng），在测试组（zǔ）中（zhōng）当将cutoff值设成0.69时，灵（líng）敏度为87.5%，特异性（xìng）为68.8%。

5hmC标志物与传统临床变量/危险因子（zǐ）的对（duì）比

我们评估了不（bú）同临（lín）床变量/危险因子用（yòng）于监测血管并（bìng）发症的灵敏度和特异性（见（jiàn）表1）。

信号通路分析和功能探（tàn）究

有（yǒu）并发症和无（wú）并发症病人的135个差异候选基因的功能注（zhù）释分（fèn）析表明，这（zhè）些基因（yīn）主要富集在一些经典的信号通路。错误发（fā）现率相（xiàng）关P值位于前10%和基因数目≥3的信号通（tōng）路（lù）包括由IGF1R, IL-10和FGFR2所（suǒ）介导的信号通路。由IGF1R和（hé）IL-10介导的信号通（tōng）路与胰岛素抵抗（kàng）及炎（yán）症反应相关（guān），在血管生（shēng）物学和糖尿病（bìng）发生发展过程中发挥重要作用。

Reactome相互作（zuò）用（yòng）网络的中（zhōng）心表明，泛（fàn）素编码基因（yīn）[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素（sù）A-52亚基（jī）核糖体蛋白融合产物1(UBA52)]是（shì）候选（xuǎn）基（jī）因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要连接者。在这135个（gè）差（chà）异（yì）候（hòu）选基因中, 一些基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出与糖尿病病程相（xiàng）关的（de）倾（qīng）向，表明5hmC和（hé）糖尿（niào）病血管并发症之间可能存在时间依赖性的相互作用。基（jī）于纵向时（shí）间队列的大（dà）样本（běn）研究，将可进一步明（míng）确5hmC变化和糖尿病持续时间（jiān）之间的动态关联。关于单一并发症和（hé）多（duō）种（zhǒng）并发症病（bìng）人（rén）的159个候选标志基因的功能（néng）注释研究发现（xiàn），存在（zài）细胞-细胞连（lián）接、胶原蛋白（bái）形（xíng）成、新陈代谢、细胞应激应（yīng）答信（xìn）号通路的富集，这些（xiē）信（xìn）号通路均与细胞基本功能（néng）密切相关。

血（xuè）管并发症是三分之二糖尿（niào）病（bìng）病人的死亡原（yuán）因，若能及早（zǎo）有（yǒu）效控（kòng）制血管并发症的发生，将极大地改善糖尿病病人的生存质量。该研究建立了（le）一种利用cfDNA进行2型糖尿病（bìng）血管并发症监测（cè）的无创便捷方法，较（jiào）目前临床标志物能（néng）更准确地监控血管（guǎn）并发症（zhèng）的发生，从而提示临床及早（zǎo）采取应对措施，有效控制病情（qíng）进展。